Nanotechnologie: innovative molekulare bildgebende Diagnostik

Die Globalisierung wird von einer epidemischen Zunahme von Adipositas begleitet. Es finden sich aktuell auch starke Zuwachsraten in Asien (z.B. in städtischen Regionen in China), wobei Kinder und Jugendliche besonders betroffen sind. Adipositas verursacht ein breites Spektrum von Folgeerkrankungen, allen voran Typ-2-Diabetes und Atherosklerose.

AS-Plaque als pathologisches Substrat

Vor allem Stammfettsucht mit abdomineller Fettakkumulation ist mit koronarer Herzerkrankung (KHK) und Herzinfarkt vergesellschaftet. Hypertonie und Schlaganfall sind weitere lebensbedrohliche klinische Endpunkte. Insgesamt sind kardiovaskuläre Erkrankungen weltweit die häufigste Ursache für Krankheits- und Todesfälle und verursachen nicht zuletzt auch explodierende ökonomische Kosten. Das pathologische Substrat ist ein Arterioskleroseherd (AS-Plaque). Diese AS-Plaques entstehen aus einer immunmediierten Entzündungsreaktion um einen Fetteinlagerungskern der Gefäßwand. Insulinresistenz mit starken Insulin- und Blutglukoseschwankungen, oxidativer Stress und eine Dyslipidämie bewirken eine Endothelschädigung. Dies begünstigt die Einlagerung von Lipiden in die Gefäßwand, Monozyten und Zellen der adaptiven Immunabwehr folgen. Die im Rahmen der chronischen Entzündung freigesetzten Wachstumsfaktoren bewirken unter anderem eine Proliferation der glatten Muskelzellen. Chronische Infektionen (z.B. Chlamydien) wurden in der AS-Pathophysiologie weiters intensiv diskutiert, konnten aber bisher nie wirklich überzeugend als kausales Element nachgewiesen werden. Abgesehen vom breiten Spektrum möglicher Ursachen ist die AS ein chronischer Prozess, wobei es in der Regel erst Jahre nach Krankheitsbeginn zu kritischen klinischen Endpunkten kommt. Die pathologische Dynamik dieser langen Vorlaufzeit ist Gegenstand intensiver Forschung. In der Regel werden AS-Läsionen durch eine entzündliche Perpetuierung instabil, wobei dann die Wahrscheinlichkeit für ein klinisches Geschehen (z.B. Myokardinfarkt) rapide ansteigt. Verbesserte frühdiagnostische Erkennung und konsequente therapeutische Manipulation dieser kritischen Läsionen retten Menschenleben, verhindern Spätfolgen und entlasten das Gesundheitssystem.

NanoPlaque-Projekt

Die Forschung im Rahmen des NanoPlaque-Projekts der Medizinischen Universität Graz zielt auf eine solche verbesserte Früherkennung ab. Mit Methoden der Grundlagenforschung werden Nanocarrier-Biomarker-Konstrukte entwickelt, die vorerst in Tiermodellen für Atherosklerose (ApoE-defiziente Maus, Watanabe-Kaninchen-Modell [Watanabe Hereditable Hyperlipidemic – WHHL – Rabbits]) durch selektive Bindung eine Erkennung von kritischen Plaques und deren Visualisierung mit molekularen Bildgebungsverfahren ermöglichen. Wir haben uns auf bestimmte Nanopartikel (z.B. Liposome, Protikel), die von einem Konsortium (http://www.bionanonet.at, http://www.nano-health) entwickelt wurden, konzentriert. Diese können mit kontrastgebenden Atomen (z.B. Gadolinium, Eisen) dicht bepackt werden. Eine besondere Expertise unserer Forschungsgruppe besteht darin, diese Nanopartikel „scharf“ zu machen, d.h., sie werden mit Biomarkern zu Nanokonstrukten verknüpft, um eine selektive Bindungsaffinität an kritischen, vulnerablen Plaques zu erreichen.

Eine immunmediierte Entzündungsaktivierung ist ein zentrales Ereignis, das stabile AS-Plaques aktiviert. Dadurch dünnt sich die Deckschicht über der Läsion aus, es kommt zur Gerinnungsaktivierung und zu einer entzündlichen „Durchwanderung“ aller Strukturen (Monozyten/Makrophagen, T-Zellen, Metalloproteinasenaktivierung, Th-1-Zell-Zytokin-Produktion, z.B. Gamma-Interferon, Synthese von CXCR3-Chemokinen etc.). Durch diese Instabilisierung steigt die Wahrscheinlichkeit von kritischen Ereignissen, die zu Gefäßverschlüssen führen, rapide an, wobei dieses Geschehen, wie neuerdings beschrieben, weniger juxtaläsionell, sondern eher distal stattfindet. Die entzündliche Auflockerung des Gerinnsels über der ausgedünnten AS-Plaque-Deckschicht erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass sich Fragmente lösen und weiter distal das Gefäß okkludieren. Gleichzeitig kommt es zu einer qualitativen Veränderung der „System“-Entzündung, wobei durch Apoptosevorgänge vermehrt sogenannter „cell dust“ in der Zirkulation auftritt und weiters eine generelle Gerinnungsaktivierung okkludierende Ereignisse begünstigt.

Die Hypothese von NanoPlaque geht davon aus, dass in diesem Szenario die Bereitschaft zur Bindung von antientzündlich agierenden Proteinen an der AS-Gefäßwandläsion besonders stark ist. Daher werden antientzündlich wirksame Biomarker in unserer Nanokonstrukt-Entwicklung besonders berücksichtigt. Darüber hinaus fokussieren wir bei der Auswahl von selektiven Andockmolekülen auf den Prozess der Lipidperoxidation, der eine maßgebliche Rolle bei der Entstehung von AS spielt. Im Prinzip stehen für die Experimente vier verschiedene Nanopartikelkategorien (i.e.: Liposome, Protikel, Thiomere, PLA-HSA-Partikel, Details siehe Abb. 1) zur Verfügung. Sie wurden vom sogenannten Nano-HEALTH-Konsortium entwickelt. Nano-HEALTH (www.nano-health.at) ist ein Netzwerkprojekt im Rahmen der österreichischen „Nano-Ini-tiative“ zur Förderung der Nanowissenschaften und Nanotechnologien. Dieses Verbundprojekt hat im März 2005 begonnen und hat eine Gesamtlaufzeit von 7 Jahren. In Nano-HEALTH arbeiten zurzeit 18 Projektpartner zusammen. Während der ersten vier Projektjahre wurde die Nanopartikelplattform, bestehend aus vier Nanopartikelfamilien (NPs), aufgebaut und für ihren Einsatz zum gezielten Wirkstofftransport und für Diagnosezwecke optimiert. Das Projekt Nano-HEALTH wird von Joanneum Research (http://www.joanneum.at) wissenschaftlich und von Bio-NanoNet (http://www.bionanonet.at) administrativ koordiniert.

Das NanoPlaque-Projekt konzentriert sich auf die Verwendung von Liposomen und Protikeln (Protamin-Oligonukleotid-Komplexe), weil diese Nanopartikel sehr gut mit kontrastgebenden Substanzen (z.B. Gadolinium) beladen werden können. Weiters sind Liposome inert und untoxisch sowie im humanen System schon in sicherer therapeutischer Verwendung (z.B. liposomales Amphotericin). Bezüglich der Nanopartikel und ihrer Konstrukte werden im Rahmen des Konsortialprojekts systematisch umfangreiche Toxizitätstests durchgeführt, um ihre ungefährliche Anwendbarkeit zu gewährleisten.

Adipokine

In der Auswahl der Andockproteine, die mit Liposomen und Protikeln zu Nanokonstrukten verarbeitet werden, haben wir uns primär auf Adipokine konzentriert. Adipokine weisen komplexe endokrinologische und immunmodulative Eigenschaften auf (Abb. 2). Aufbauend auf Ergebnissen des STYJOBS/EDECTA-Projekts (Details siehe: http://www.meduni-graz.at/styjobs, http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00482924), wo im Rahmen einer großen klinischen Studie Zusammenhänge zwischen Entzündung, Adipokinproduktion, Adipositas und Atherosklerose untersucht werden, haben wir bei NanoPlaque vor allem Adiponektin als antientzündlich effektives „targeting protein“ zur Generierung von Nanokonstrukten untersucht. Adiponektin stellt neben Leptin das am häufigsten vorkommende Proteinprodukt der Adipozyten dar. Es kommt in einer niedermolekularen Form, bestehend aus einem globulären und einem Kollagenanteil, vor. Dieses Monomer oligomerisiert zu hochmolekularen Formen (Abb. 3).

Die Forschung zu NanoPlaque identifizierte bisher die globuläre Fraktion von Adiponektin als ideal zur Bindung an Nanopartikel. In zahlreichen, technisch sehr aufwendigen experimentellen Entwicklungsschritten konnte eine stabile Bindung von globulärem Adiponektin an Liposome und Protikel erzielt werden. Beide, Liposome und Protikel, können z.B. mit Gadolinium oder Eisenpartikeln beladen werden. Im Gegensatz zu Liposomen, die durch Polyethylenglykol-Überzug immunologisch inert sind („Stealth Liposomes“, Herstellung von Doz. Dr. Ruth Prassl, Österreichische Akademie der Wissenschaften), zeigen Protikel (Entwicklung von Prof. Dr. Andreas Zimmer, Karl-Franzens-Universität Graz, Institut für Pharmakologie) eine besondere Affinität für Monozyten/Makrophagen. Diese unterschiedlichen Eigenschaften können für selektives molekulares Imaging genützt werden.

ApoE-defiziente Mäuse

Die bisher im ApoE-defizienten Mausmodell für Arteriosklerose erfolgreich eingesetzte Verwendung von globulärem Adiponektin als „Targeting“-Protein für AS-Plaques wurde patentrechtlich geschützt.

Die Abbildungen 4 bis 7 zeigen die selektive Bindung von globulärem Adiponektin (gAd) an die Oberfläche von Plaques im Bereich der Aorta descendens von ApoE-defizienten Mäusen. Konstrukte aus gAd und Liposomen weisen eine deutliche Signalverstärkung auf. Diese Experimente wurden mit Fluoreszenz-markiertem Adiponektin, Liposomen bzw. gAd-Liposomen-Kons-trukten ex vivo an Aortensektionen von ApoE-defizienten Mäusen durchgeführt. Bei weiteren Experimenten wurde gAd in vivo in ApoE-defiziente Mäuse injiziert. Nach einer Zirkulationsdauer von ca. 1 Stunde wurde auch hier eine selektive Bindung von gAd an Plaquestrukturen beobachtet.

Zusammenfassung

Bisher konnte im ApoE-Mausmodell gezeigt werden, dass globuläres Adiponektin eine hochselektive Bindungsaffinität zur Oberfläche von AS-Plaques zeigt. Dies konnte auch für andere antientzündlich wirksame Biomarker und monoklonale Antikörper gezeigt werden. Nanokonstrukte, bestehend aus diesen Biomarkern und Liposomen sowie Protikeln, sind in stabiler Form erzeugbar. Die Nanokonstrukte zeigen in den Fluoreszenzfärbungen, die mittels konfokaler Laserscan-Mikroskopie sichtbar gemacht werden können, eine Verstärkung des Bindungssignals. Liposome können ausreichend mit Gadoliniumatomen und Eisenpartikeln beladen werden, sodass ein gutes Kontrastsignal im Gewebe für kernspintomografische Darstellungen erreicht wird. Derzeit werden solche Konstrukte aus Liposomen und globulärem Adiponektin an Watanabe-Kaninchen (WHHLs) getestet. Diese WHHL-Kaninchen entwickeln – menschenähnlich – vulnerable Plaques. Die Auswertungen der Kernspintomografiesequenzen werden klären (in Kooperation mit Prof. Dr. Rudolf Stollberger, Peter Opriessnig, Institut für Medizintechnik, Technische Universität Graz), welche Nanokonstrukte für die molekulare Bildgebung von Atherosklerose am besten verwertbar sind. Insgesamt bietet der Einsatz von Nanotechnologie interessante Möglichkeiten, um die biologischen Eigenschaften bestimmter Moleküle für den gezielten Transport von kontrastgebenden Substanzen einzusetzen. Die antientzündliche Wirkung von Adiponektin kann neben der Bildgebung auch zur Stabilisierung von Entzündungsprozessen in solcherart selektiv detektierten, kritisch perpetuierten Atheroskleroseläsionen eingesetzt werden.

Literatur beim Verfassser

Autoren: Prof. Dr. Harald Mangge, Mag. rer. nat. Gunter Almer, Klinisches Institut für Medizinische und Chemische Labordiagnostik, Auenbruggerplatz 36, 8036 Graz, Tel.: 0316/385-83340, Fax: 0316/385-4024

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